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Covalent Inhibiteurs mimétiques de la guanosine du gène KRAS G12C

RAS mutations

sont fréquemment observés dans les tumeurs malignes

et soutien

diverses caractéristiques du cancer, y compris l’instabilité génomique, la prolifération 1,2 des cellules, 3 la suppression de l’apoptose, 4 reprogrammation du métabolisme, 7,8 altération

du microenvironnement, 9,10 évasion des réponses immunitaires, 11,12 et la promotion des métastases.13,14 Conformément à son

influence envahissante sur la fonction des cellules cancéreuses, l’extinction de l’oncogène

KRAS dans de nombreux modèles de tumeurs établies entraîne une régression tumorale.8,15,16 Ciblant RAS en tant que thérapeutique

La mesure est donc hautement prioritaire.17Les mutations RAS semblent tomber dans des catégories fonctionnelles et

volonté

KRAS G12C est la mutation RAS la plus fréquente dans les cellules non à petites cellules.

cancer du poumon, la principale cause de décès par cancer aux États-Unis.22 Auparavant, nous avons émis l’hypothèse que

mutation cystéine dans KRAS G12C pourrait permettre le développement de covalents

Inhibiteurs compétitifs GTP. Nous avons pensé que cibler l’actif

site de KRAS perturberait probablement la signalisation médiée par KRAS G12C

sur l’observation que la signalisation RAS est fondée sur l’identité

de son ligand lié.23,24Nous avons développé un PIB mimétique

inhibiteur SML-8-73-1, qui contient

un électrophile alpha-chloroacétamide et réagit avec Cys12 après inhibiteur

liaison à KRAS G12C (Schéma 1). SML-8-73-1 est également capable de rivaliser in vitro avec une forte concentration de GDP et de GTP et diminue l’affinité

de KRAS G12C pour le domaine de liaison RAS (RBD) de BRAF.25 En outre, le profilage basé sur la protéomique non biaisée

a montré que SML-8-73-1 est très sélectif pour KRAS G12C entre autres

Protéines de liaison GTP.26 Néanmoins, SML-8-73-1

contient plusieurs groupes phosphate chargés et ne peut pas passer à travers

la membrane cellulaire. Stratégies de mise en cage pour protéger les phosphates chargés

Le schéma 1Analogue basé sur des bioisostères diphosphatePour permettre des stratégies de mise en cage et d’explorer la

possibilité d’autre

fractions chimiques qui pourraient améliorer les propriétés du diphosphate

pharmacophore pour le ciblage covalent de KRAS G12C, nous avons étudié

structure – relations d’activité (SAR) sur une série d’analogues

de SML-8-73-1 qui a varié le groupe diphosphate ainsi que le lieur

moitié. Nous rapportons ici la caractérisation biochimique de ces composés

y compris une structure de cristal à rayons X illustrative démontrant la clé

difficultés inhérentes à cette approche.Un composé diphosphate,

SML-8-73-1 souffre de produits chimiques et enzymatiques

l’instabilité, étant donné que la liaison de l’anhydride phosphate est sujette à l’hydrolyse.27 Cela pose deux problèmes: premièrement,

composés instables sont intrinsèquement désavantageux d’une pharmacocinétique

la perspective; et deuxièmement, une stratégie de mise en cage sera probablement nécessaire

pour protéger les atomes chargés dans le phosphate pharmacophore pour améliorer

perméabilité cellulaire, et le volume stérique résultant peut encore déstabiliser

la liaison anhydride phosphate. Pour résoudre ces problèmes potentiels, le

l’oxygène central a été remplacé par un groupe méthylène. Le correspondant

bisphosphonate est considéré comme résistant aux acides et enzymatiques

hydrolyse à la liaison P, 29,30 et a été largement utilisé comme isostère du diphosphate.Synthèse des bisphosphonates utilise une séquence de réaction en un seul pot,

à partir de l’addition nucléophile – réaction d’élimination entre

méthylènebis (dichlorure phosphonique) et la guanosine protégée par l’acétonide 3 donnant du chlorure phosphonique 5, qui était

ensuite réagi avec de l’éthanolamine 6 pour donner phosphorique

ester 7 après trempe aqueuse (Schéma 2). Déprotection dans des conditions acides suivie

par acylation sélective en utilisant NHS-ester activé 9

s’élever au bisphosphonate diester désiré 10 (XY-01-103).

Cette séquence synthétique permet un accès facile et rapide au bisphosphonate

analogues 10 à 20 avec divers lieurs

et différents analogues de guanine, en utilisant différentes réactions d’alcool

partners.Scheme 2Synthèse des analogues des bisphosphonatesDifférentes voies ont été utilisées pour synthétiser

divers bisphosphonate

isostères. Synthèse de l’intermédiaire phosphonate 25 commencé

avec couplage DCC de l’acide diéthylphosphonoacétique 21 et

l’éthanolamine 22, et l’acétate de phosphoryle 23 résultant a été déprotégé et couplé à la guanosine 3 pour donner l’acétate de phosphoryle 25 (Schéma 3). De même, l’acétate de phosphoryle 29 a été obtenu par une séquence altérée. Déprotection et sélective

l’acylation des intermédiaires 25 et 29 a donné

s’élever aux composés d’acétate de phosphoryle 30 et 31, respectivement. La synthèse de 47 a commencé à partir de la sulfonylation

Le sulfonamide 34 résultant a été déprotoné et mis à réagir avec du diéthyl chlorophosphate 35. Après déprotection, le sel de collidine 37 a été couplé à la guanosine 3 pour donner du sulfamoyl phosphonate 44, qui a été déprotégé et acylé pour fournir 47 (XY-02-075). . Pour 48, l’addition séquentielle de l’éthanolamine 22 et de la guanosine 3 à l’isocyanate de chlorosulfonyle 38 a donné naissance au sulfamate 45 qui, après déprotection

a été acylé pour donner 48. Alternativement, la synthèse

de 49 a commencé à partir de la réaction de l’éthylènediamine 40 avec l’acétate de chlorosulfonyle 41. Après

saponification et couplage DCC avec la guanosine 3 ont donné

le sulfamoylacétate requis 46, qui a été déprotégé

et acylé pour donner 49.Schéma 3Synthèse du bisphosphonate

IsostèresPour mesurer le déplacement du PIB, nous avons utilisé un

“ chimiosensor

essai &#x0201d ;, dans lequel KRAS G12C chargé de GDP recombinant purifié est

incubé avec le composé, puis sondé à différents moments avec un

composé de sonde qui détecte la présence de G12C libre (n’ayant pas réagi)

thiol. Ce test fournit une mesure composite du déplacement cinétique

du PIB et de l’inactivation covalente du KRAS G12C (Figure S1) .26Pour déterminer

les affinités relatives des composés nous avons mesuré kinact / Ki en utilisant GMP-stabilisé

KRAS G12C (figure S2). Pour obtenir ces

valeurs que nous avons utilisé la stratégie préconisée par Copeland31 où les taux de réaction sont tracés vs les concentrations de composés

et correspond à la courbe décrite par l’équation kobs = kinact [I] / (Ki + [I]). En utilisant

l’ajustement, les estimations pour kinact et Ki peuvent être extraites (figure S2C, D). Pour ce test, KRAS G12C libre nucléotidique libre a été

préparé et stabilisé avec un excès de GMP, qui a une faible affinité

de 3,5 × 104 M – 1 pour RAS.32 RAS stabilisé par GMP est incubé avec composé

puis sondé avec une sonde GTP-desthiobiotin qui, de manière similaire à largement

Les sondes ATP-biotine (ActivX) utilisées, 33,34, contiennent

l’anhydride acyl-phosphate réactif qui réagit avec la lysine 16 de KRAS.

La protéine desthiobiotinylée est détectée en utilisant AlphaScreen (PerkinElmer)

réactifs (figure S2A). Parce que l’ActivX

et les réactifs AlphaScreen sont utilisés en combinaison, nous appelons ce test

ActivAlpha (Figure S2D) .Un troisième

l’essai consiste à incuber G12C KRAS recombinant avec

nouveaux inhibiteurs et ensuite effectuer la spectrométrie de masse à ionisation par électrospray

comme indiqué précédemment.25 Le pourcentage d’étiquetage

de la protéine peut être détectée comme le montre la figure S3.Pour répondre à notre objectif global de développer GTP-compétitif

inhibiteurs

qui ont des effets anticancéreux dans les cellules, les composés auront probablement besoin

pour obtenir une inhibition RAS adéquate bien dans l’échelle de temps typique

du renouvellement des protéines RAS; la demi-vie a été estimée à 12 – 24

h.35,36 Nous avons déjà effectué une cinétique rudimentaire

simulations37 montrant que les inactivateurs G12C KRAS

avec une kinact de 0,6 min – 1 et Ki de 10 nM produira 50% d’inhibition

de KRAS G12C en 5 h. Nous les adoptons donc comme des normes préliminaires

pour le développement d’inhibiteur. Néanmoins, il convient de noter que

Le test ActivAlpha utilise un excès de GMP pour stabiliser la protéine KRAS

et, contrairement à la situation in vivo, ne nécessite pas

déplacement du PIB ou du GTP.Dans le test ActivAlpha diphosphate 1 (SML-8-73-1)

montre un excellent Ki de 9 nM et relativement

kinact rapide de 0,86 min – 1, ce qui est compatible avec l’électrophile réactif chloroacétamide

de SML-8-73-1. Cependant, le méthylènebisphosphonate correspondant

l’analogue 10 perd 300 fois l’affinité de liaison (Ki), et les étiquettes KRAS à un taux qui est 11 fois

plus lent (tableau 1). Ce

souligne l’importance des interactions entre l’atome d’oxygène

du diphosphate et des différents résidus dans la boucle P de KRAS.

En remplaçant l’oxygène central par un groupe méthylène en 10, les deux pKa du

l’acide phosphorique et les longueurs de liaison et les angles de liaison du P – X – P

la liaison (X = O, CH2) est modifiée, ce qui peut entraîner

affinité.38 Pour retrouver l’électronique et

propriétés conformationnelles comme dans SML-8-73-1, difluorométhylène et

des groupes monofluorométhylène ont été incorporés dans les composés 11 et 12, respectivement. Les phosphonates fluorés sont

largement utilisé dans l’industrie pharmaceutique comme isostères de phosphate

et se révèlent être de meilleurs mimétiques de phosphate que les phosphonates39,40. Dans ce cas, le difluorométhylène

analogue de bisphosphonate 11 améliore l’affinité

KRAS par 7 fois, comparé à l’analogue de bisphosphonate 10, alors que l’analogue 12 de monofluoromethylene bisphosphonate a montré une affinité inférieure et un taux de étiquetage plus lent.41 Tableau 1SAR des analogues de bisphosphonate et

Isostères diphosphates L’analogue d’acrylamide de SML-8-73-1 (2) présente

un taux de kinact constant supérieur à celui de la formule contenant du # -chloroacétamide

SML-8-73-1, bien qu’il soit généralement admis que le α -chloroacetamide

l’ogive est plus réactive envers le groupe cystéine que l’acrylamide42. Nous avons postulé que la longueur entre la

β -phosphate et le site réactif de l’acrylamide en 2 peut être optimal pour la formation de liaison covalente requise.

Analogues avec un linker propyle (13, 14)

amélioré l’affinité pour KRAS G12C, peut-être en raison d’une combinatoire

effet de l’espacement optimal, et une meilleure trajectoire de l’électrophile

ogive vers la substitution nucléophile de Cys12. Au contraire,

analogique 20, avec un électrophile interne et plus courte

distance entre le β -phosphate et le site réactif pour Cys12,

montré une perte totale d’activité.Nous avons émis l’hypothèse qu’un

éditeur de liens avec une trajectoire préférée

peut améliorer encore l’efficacité de l’étiquetage, et une série d’analogues

avec des linkers cycliques ont été synthétisés. Dans le cas de 16 avec un lieur de pyrrolidine, un plus grand kinact de 2.2 min – 1 a été observé, avec un étiquetage rapide

de G12C KRAS dans le test chimiosensor (t1 / 2 de 1,1 h). Analogues contenant du cyclopentane 18 et 19 qui placent l’azote dans la position exocyclique également

a montré plus de kinact, cependant les affinités

pour ces deux composés sont significativement plus faibles. Un lieur de pipéridine

dans 17 n’a pas amélioré l’affinité ou l’efficacité de marquage. Nous avons également examiné la substitution d’un ou des deux phosphates avec carbonyle

ou des groupes sulfonyle. Les résultats ont montré que les deux phosphates sont cruciaux

en réalisant une affinité de liaison élevée pour KRAS; en substituant un ou les deux

les phosphates abaissaient significativement l’affinité et entraînaient un étiquetage plus long

temps. Parmi ceux-ci, l’analogue de phosphonylsulfonamide 47 (XY-02-075) avait le plus faible Ki de 1,6

μ M et a t1 / 2 de 2,3 h. Un cocrystal

structure de XY-02-075 avec KRAS G12C a montré un hydrogène intramoléculaire

liaison entre l’hydrogène sulfonamide et l’oxygène phosphonate

(voir ci-dessous). Analogue phosphoryl acétate 31, dans lequel

le α -phosphate a été remplacé par un groupe acétate, a montré une

Ki inférieur à 7 fois que le correspondant

phosphoryl acétate inversé 30. Cette observation est en

aligner avec les rapports précédents que les interactions entre le β -phosphate

dans le PIB et Ras ou le magnésium sont plus forts que celui du α -phosphate.32 Remplacement supplémentaire du phosphonate restant

avec sulfonamide dans les composés 48 et 49 a fait

n’améliore pas significativement l’affinité. Incorporation d’un squaryldiamide

groupe, un isostère commun pour les diphosphates et les bisphosphonates, 43 sur 50 ont abouti à une faible affinité.Nouveaux analogues du PIB n’ont pas atteint l’efficacité d’étiquetage comparable

observé pour SML-8-73-1. Pour mieux comprendre pourquoi nos analogues étaient

inférieure à SML-8-73-1, nous avons déterminé la structure cristalline aux rayons X

de XY-02-075 lié à KRAS G12C. Etiquetage complet du KRAS G12C avec

XY-02-075 a été confirmé avant la cristallisation en utilisant la spectrométrie de masse

(Figure S3). Les cristaux étaient dans le monoclinique

groupe d’espace C2 avec une cellule unitaire similaire

d’autres structures KRAS obtenues précédemment.26 Remplacement moléculaire en utilisant la structure liée au PIB de WT KRAS comme recherche

modèle (PDB 4OBE) a été utilisé pour obtenir des informations de phase, et le modèle final a été affiné

à une résolution de 2,70 Å avec R-travail de 28,0%, R-libre de 33,5%, et le facteur B moyen de

89.0 Å 2 (Table S2) .La structure du domaine G est similaire à celle du RAS précédemment résolu

les structures de protéines de la famille, y compris la liaison SML-8-73-1

structure (PDB 4NMM) (RMSD = 0,43 Å 166 atomes alignés). Densité positive continue

reliant l’atome de carbone terminal de XY-02-075 à Cys12 confirmé

un lien covalent entre le composé et la protéine (figure S4). La conformation des résidus entourant la guanosine

site de liaison, y compris les motifs P-loop (résidu 10 – 17), 57DXXG, 116NKXD et 146SAK, étaient similaires

à la structure liée à SML-8-73-1 avec plusieurs différences. Important

il y a un manque de densité où un ion de magnésium et de l’eau coordonnée

molécules ont été observées dans presque toutes les structures précédentes de

HRAS et KRAS (figure ​ figure 11B, C). En outre, dans la structure liée XY-02-075, nous avons observé un hydrogène

liaison entre l’atome d’oxygène de l’amide carbonyle et l’azote de l’épine dorsale

atome de Gly13, alors que le groupe amide lieur formé une liaison hydrogène

avec le groupe ε -nitrogen de Lys16 dans la structure SML-8-73-1.

Nous avons également noté un déplacement vers l’extérieur des résidus de l’interrupteur I Tyr32 et

Asp33 (Figure ​ Figure11A).

Enfin, en raison de la faible densité électronique et d’un facteur B élevé, les résidus 63 et 64 de l’interrupteur II ne pouvaient pas être sans ambiguïté

assigné dans notre modèle.Figure 1Comparaison entre G12C dans le complexe avec XY-02-075 (cyan / bleu)

et

SML 8-73-1 (gris / orange). (A) superposition structurelle de nucléotide

poche de liaison: l’interrupteur I est surligné dans la structure liée XY-02-075

en jaune et en SML-8-73-1 chez le saumon. Tyr32 et … Remplacement de β -phosphate avec sulfonamide apparemment

pistes

à la dissociation de l’ion magnésium et de son réseau d’eau coordonné.

Par rapport à la structure SML-8-73-1, l’interaction pontée au magnésium

entre le β -phosphate et Tyr 32 et Asp 33 est perdu lorsque lié

à XY-02-075. De plus, une liaison hydrogène intramoléculaire forme

au sein de XY-02-075 entre l’hydrogène de l’amide du sulfonamide et

l’atome d’oxygène du phosphonate α

la conformation de l’inhibiteur par rapport à SML-8-73-1 (figure ​ figure 11B, C). Ce kink contribue

au déplacement des résidus de l’interrupteur I Tyr32 et Asp33 de 3,3 Å

par rapport à la position observée dans la structure liée à SML-8-73-1.

La conformation pliée de XY-02-075 ne permet pas non plus le sulfonamide

oxygènes pour former des liaisons hydrogène avec les atomes d’azote de squelette de

Résidus de boucle P Gly15 et Lys16 tels qu’observés avec SML-8-73-1. Par conséquent,

l’orientation du groupe amide de liaison de XY-02-075 est décalée

par rapport à SML-8-73-1.Pour confirmer que nos composés font

pas coordonner efficacement avec

Mg2 +, nous avons réalisé une étude de titration 31P RMN MgCl244 contre des concentrations fixes

du PIB, du GTP et de plusieurs de nos composés. Ceux-ci ont montré un décalage dépendant du Mg2 + dans le signal 31PNMR avec le demi-maximal

effet à ∼ 0.5 équiv pour le PIB et le GTP et un plateau de 2 équiv.

Cependant, avec la même concentration de nos composés phosphonates,

jusqu’à 20 équivalents de Mg2 + étaient nécessaires avant le changement

le signal a commencé à plateau, ce qui démontre que nos analogues de phosphonate

lier Mg2 + avec une affinité beaucoup plus faible (Figures S5, S6). Esters mono-, di- et triphosphates

sont omniprésents dans biologique

molécules incluant de petites molécules telles que les nucléotides, l’acétyl-CoA,

inositides, et phospholipides et en tant que modifications post-traductionnelles

à la sérine, à la thréonine et à la tyrosine sur de nombreuses protéines. Par conséquent, il

n’est pas surprenant qu’une foule de protéines protéines et des poches de liaison

ont évolué pour utiliser ces molécules comme substrats, cofacteurs, et

motifs de reconnaissance. Alors que les phosphates sont des éléments de liaison puissants

et améliorer considérablement la solubilité dans l’eau des composés auxquels ils

sont attachés, ils entravent généralement la diffusion passive à travers un lipide

bicouche et sont donc généralement pas trouvé dans les médicaments à petites molécules.

Les chimistes médicinaux ont trouvé un certain nombre de bioisostères phosphatés

sont reconnus par ces poches, mais généralement il y a un

perte d’affinité de liaison.40 Une alternative

approche est de créer des prodrogues de phosphate dans lequel le phosphate est

dévoilé après le métabolisme intracellulaire par une enzyme appropriée. En contraste frappant avec le succès relatif dans la recherche de monophosphate

mimétiques, il y a eu beaucoup plus d’efforts limités et de succès dans le développement

mimétiques diphosphates. Par exemple, les squaryldiamides ont été étudiés

comme substitut du diphosphate dans la mannosyltransférase ciblant le sucre-nucléotide

mimétiques; 43 phosphinylformate a été utilisé

comme isostère diphosphate dans les inhibiteurs de la squalène synthétase; 45 en outre, sulfonylbenzoyl-nitrostyrènes ont été

explorés comme des inhibiteurs de type bisubstrate de l’EGFR, dans lesquels le sulfonylbenzoyle

le fragment a servi de mimique de diphosphate.46 Cependant, ces bioisostères souffrent de la bioactivité réduite quand

par rapport à leurs homologues diphosphate. Nous avons fait face à ce défi

en considérant comment générer une version pénétrante cellulaire de notre prototype

Composé de marquage G12C KRAS SML-8-73-1. Nous avons envisagé deux possibles

approches: trouver des mimétiques phosphatés non chargés ou créer du diphosphate

prodrogues. Ici, nous avons décrit la synthèse et la caractérisation biologique

de 18 analogues où nous avons exploré les remplacements de phosphate et “ linker ”

variation. Nous avons découvert que des changements relativement subtils au diphosphate

Ce groupe a entraîné une réduction spectaculaire de l’affinité et de l’efficacité de l’étiquetage. Selon notre analyse structurale, la perte d’affinité semble

être, au moins dans certains cas, motivée par la perturbation de la coordination

entre nos composés et le magnésium entraînant la perte de nombreux

interactions observées dans les structures liées au ligand natif. Futurs efforts

pour optimiser le phosphate pharmacophore bénéficiera probablement de l’analyse

de coordination entre les composés et Mg2 +. Cette structure

ajoute également des preuves aux données déjà étendues soutenant le très

nature dynamique des commutateurs RAS et leur dépendance au ligand lié

pour échantillonner certaines conformations. Dans la structure rapportée ici,

l’interrupteur I (en particulier les résidus 32 et 33) est déplacé vers l’extérieur pour recevoir

le XY-02-075 plié, qui ne coordonne pas le magnésium et l’eau

molécules. Cela suggère que même de petites altérations à un ligand lié

à KRAS entraînera des changements conformationnels susceptibles de perturber

les interactions avec les effecteurs RAS qui utilisent le commutateur I ou le commutateur II

interfaces. La liste de ces protéines comprend des protéines importantes

transducteur des cascades de signalisation majeures de RAS, y compris PI3K et

B-RAF. Cela suggère que le développement d’inhibiteurs compétitifs GTP,

si possible, sera très susceptible de perturber cellulaire RAS-dépendante

des processus tels que l’oncogenèse dans le cas de RAS activé.Un composé prometteur obtenu dans cette étude, 11, possède

une fraction de difluorométhylène bisphosphonate et présente une réduction de 40 fois

affinité par rapport à SML-8-73-1, mais a l’avantage potentiel de

création de promédicament plus facile en raison de ne pas avoir l’instabilité chimique

cela résulte de la liaison de l’anhydride phosphate. Les efforts actuels se concentrent

sur le développement de promédicaments d’analogues de difluorométhylène bisphosphonate

ainsi que le remplacement de l’hétérocycle guanine avec des fragments qui

posséder une meilleure affinité de liaison afin de retrouver l’affinité perdue

la poche de liaison au phosphate.